Una conferma alla teoria degli equilibri punteggiati: uno studio evidenzia come il gradualismo non sia il meccanismo che si attua in biologia.

Variazioni genetiche graduali si manifestano come salti che mettono in discussione le ipotesi di singole mutazioni selezionabili e propongono invece l’esistenza di attrattori.

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Proprietà emergenti dell’evoluzione dei geni:

specie come attrattori nello spazio fenotipico

Eli Reuveni

Mouse Biology Unit, European Molecular Biology Laboratory (EMBL) Monterotondo, Italy

Alessandro Giuliani

Istituto Superiore di Sanità, Environment and Health Department, Viale Regina Elena 299, 00161, Roma, Italy

(Traduzione di Alessandro Giuliani e JdM, testo originale all’indirizzo  http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378437111006789)

Abstract

 

La questione di come il carattere discreto dei fenotipi emerga da una

distanza metrica genetica continua è l’argomento principale di due teorie evolutive contrastanti: gli equilibri punteggiati (evoluzione stabile interrotta da salti puntuali e discreti osservabili a livello fenotipico) e gradualismo filetico (evoluzione regolare e lineare con cambiamenti  fenotipici rilevanti corrispondenti all’accumulazione di un numero sufficiente di cambiamenti microscopici coerente con una relazione univoca tra distanza genetica distanza fenotipica).

Identificare un salto fenotipico a livello molecolare è fondamentale per sostenere il primo modello di evoluzione. Per questo scopo abbiamo utilizzato sequenze di DNA di ~ 1.300 geni da 6 popolazioni isolate di lieviti Saccharomyces Cerevisiae. Dimostreremo che mentre la misura della distanza genetica mostra un continuum tra distanza di lignaggio senza evidenze di stati discreti, lo spazio fenotipico presenta solo due  stati possibili (discreti) che possono essere associati con un salto del fenotipo della specie. Il fatto che tale salto si estenda per una gran porzione del genoma e segua da una distanza genetica continua è una prova del concetto che la relazione genotipo – fenotipo non è univoca e può avere importanti implicazioni nella ricerca  delle malattie legate a mutazioni genetiche. Abbiamo usato questa scoperta in analogia alle dinamiche ad attrattori multipli e mostrato che l’equilibrio punteggiato potrebbe essere spiegato nel quadro della  dinamica non lineare.

1. Introduzione

            La selezione naturale Darwiniana descrive l’adattamento come il fattore chiave per il successo della riproduzione, determinando così i due possibili destini di sopravvivenza ed estinzione [1]. Questa dinamica governa la progressiva variazione di traiettoria dell’evoluzione imponendo piccoli passi di adattamento verso il più vicino picco adattativo [2]. Quando si passa alla spiegazione della comparsa di nuove specie, questo processo di ottimizzazione generalmente continuo necessita di ulteriori specifiche [3]. L’emergere di una nuova specie si verifica comunemente dopo l’isolamento parziale o totale delle popolazioni dall’origine parentale comune (speciazione allopatrica, fig.1 ) [4]. Anche se il quadro allopatrico è ampiamente accettato, c’è ancora disaccordo per quanto riguarda il progresso evolutivo osservato a livello di fenotipo (quindi eventualmente all’emergere di una nuova specie). Possiamo distinguere due principali teorie contrastanti: (1) gradualismo filetico [2] – la cui dinamica comunemente accettata è stata sostenuta dal neo-darwinismo e implica un’ evoluzione graduale, all’interno di questo quadro la speciazione è un processo stazionario nel quale le mutazioni si aggregano linearmente nel tempo alla variazione fenotipica fino al raggiungimento di una incompatibilità cromosomica con conseguente interruzione del flusso dei geni (ne consegue la separazione di un comune spazio ottimizzato in due), (2)  equilibrio punteggiato – la stabilità fenotipica a lungo termine è dispersa a causa di rimodellamenti morfologici conseguenti al raggiungimento di un carico critico di mutazioni come evento chiave per la transizione [5,6]. L’assenza di evidenze di una dinamica evolutiva continua nei reperti fossili pone seri dubbi sulla teoria progressiva lineare ed è  sostenuta specialmente dai paleontologi.

ψ – Processo evolutivo tra le popolazioni

φ – Processo evolutivo interno alle popolazioni

M – Processo evolutivo tra popolazioni mosaico

Fig.1 – Il diagramma illustra tre popolazioni discostatesi dalla stessa specie X, Y e Z con barriera genetica (speciazione allopatrica). Ognuna delle popolazioni comprende individui (lettere minuscole) che sono liberi di scambiare materiale genetico. La diversità genetica tra le popolazioni (linea solida, ψ) è influenzata dalle diverse condizioni ambientali dovute ai cambiamenti delle nicchie ecologiche. La diversità genetica all’interno della stessa popolazione (linee tratteggiate, φ) è meno influenzata dal contesto. La popolazione mosaico (M) è stata creata da incroci artificiali casuali di individui tretti dalle popolazioni X, Y e Z e quindi la diversità genetica tra ceppi mosaico dovrebbe mostrare un segnale di variazione tra e all’interno delle diverse popolazioni (rispettivamente ψ e φ)

Il modello del gradualismo filetico potrebbe essere affrontato con un approccio sostanzialmente lineare, laddove  l’equilibrio punteggiato richiede un approccio non lineare. Inoltre, il secondo introduce l’esistenza di stati stabili preferenziali (vagamente corrispondenti agli stati fenotipici discreti) che si trovano nello spazio della fase multidimensionale dei caratteri fenotipici. L’idea di base che sta dietro l’equilibrio punteggiato è che il raggiungimento di un equilibrio implica una relativa stabilità, i fenotipi osservati sono insomma dei quasi-attrattori , stati relativamente ‘protetti’ da ulteriori cambiamenti in quanto occupanti un minimo locale di energia in termini fisici (o un massimo locale di adattamento nel linguaggio più usuale per i biologi). Ciò implica la necessità di pensare a una sorta di paesaggio fenotipico  ‘rugged’ cioè dotato di picchi e di valli corrispondenti a diversi contenuti energetici [7,8] in cui la specie o il fenotipo discreto sono un modello privilegiato (di minima energia).

            A differenza delle simulazioni computerizzate, cioè di modelli teorici che mirano a simulare la dinamica dell’evoluzione in situazioni naturali [9-12] o di modelli teorici atti a spiegare la ridotta diversità fenotipica osservata in natura [13-16], le recenti tecnologie di sequenziamento consentono di mappare le variazioni genetiche del DNA su scala di popolazione e di descrivere gli effetti delle dinamiche evolutive in termini di risultati sperimentali. Inoltre, l’enorme quantità di sequenze e genotipi disponibili aumenta la potenza statistica che può essere raggiunta,  consentendo una migliore comprensione della relazione tra il paesaggio genotipico (DNA) e fenotipico (proteine).

            La descrizione dello spazio fenotipico si basa nel nostro lavoro sulla degenerazione del codice genetico per suddividere le mutazioni come sinonime e non sinonime, essendo le sinonime quelle che mantengono la sequenza proteica corrispondente identica, il che le rende  meno esposte ai  vincoli selettivi. Le mutazioni non sinonime provocano invece  un cambiamento nella struttura primaria della proteina corrispondente e quindi sono più soggette all’adattamento perché hanno la possibilità di causare variazioni rilevanti in termini adattivi. Quando si confrontano diverse popolazioni possiamo assegnare, a qualsiasi gene codificante specifico, un indice chiamato ω pari al rapporto tra tassi di sostituzione non-sinonimi [17] e sinonimi (dS): ω = d_N/d_S [18-20]. Precedenti studi considerano il rapporto d_N/d_S come misura della rilevanza di una data proteina all’interno di uno scenario evolutivo [21]. Le proteine che esercitano un ruolo cruciale possiedono valori dN/dS più elevati rispetto ad altre con vincoli funzionali più rilassati. Dato che d_N/d_S è un descrittore statistico gene-centrico (ogni gene ha il suo specifico valore ω, quindi indirettamente immaginando che ogni gene ‘faccia gioco a sé’), una visione globale del rapporto  d_N/d_S inteso come profilo sull’intero genoma è un’immagine delle  correlazioni che insorgono dal fatto che i geni non lavorano in isolamento ma in reti. In altre parole lo stesso gene può avere in due organismi una rilevanza differente ( e quindi un diverso  valore ω) , perché lo stesso gene occupa una posizione differente all’interno della rete di espressione. Si tratta insomma di mettere al centro dell’analisi ciò che viene chiamato epistasi (le interazioni funzionali tra geni). Sintetizzando, l spazio fenotipico considerato in questo lavoro è il profilo dei valori ω sull’intero genoma che risulta essere una firma dell’invarianza delle reti di regolazione genica (stesso profilo = rilevanza invariata dei geni = reti di relazione conservate).

Pertanto il profilo genomico di d_N/d_S considerato nel suo complesso è una sorta di firma fenotipica (stato) in termini di reti di proteine interagenti, piuttosto che un proxy per il ruolo specifico di ciascuna proteina. Questo nuovo approccio permette la comparazione dei diversi profili fenotipici d_N/d_S con le corrispondenti distanze genetiche che si profilano tra e all’interno delle popolazioni, in maniera non dissimile a quanto accade nell’analisi comparativa dell’intero spazio di espressione genica negli studi basati sulla tecnica dei microarray.

            Il lievito, Saccharomyces Cerevisiae, è il modello eucariotico più studiato a livello molecolare. S. Cerevisiae include alcuni ceppi selvatici e mosaico (ceppi di laboratorio) provenienti da diverse regioni geografiche e solitamente risiede in popolazioni di grande dimensione che bilanciano l’effetto della deriva genetica casuale, vale a dire, la fluttuazione delle mutazioni dovute ad eventi casuali [22]. Laddove i ceppi selvatici sono esposti alle condizioni naturali e il loro background genetico è influenzato in gran parte dall’ambiente circostante, i ceppi di laboratorio emergono dagli incroci artificiali dei ceppi selvatici, subendo un ridotto effetto da parte dell’ambiente ( Fig. 1). Nonostante questo, i ceppi di laboratorio sono comunque specie chiave importanti in quanto danno modo di valutare la relativa importanza delle dinamiche evolutive all’interno della stessa e fra popolazioni differenti. Inoltre, gli incroci di ceppi mosaico danno luogo ad una progenie fertile senza alcuna evidenza di barriere genetiche, il che li rende un materiale molto duttile per gli studi evolutivi.

            Ci siamo basati sulle strutture di popolazione di S. Cerevisiae, e la corrispondente elevata disponibilità di dati di variazione del DNA, al fine di delineare un possibile modello che colleghi il carattere continuo della dinamica del genotipo con il carattere discreto dei cambiamenti fenotipici osservati così fornendo al concetto di specie una definizione fisicamente motivata  in termini di attrattore in uno spazio fenotipico multidimensionale. Crediamo che questa nuova visione aiuterà a riconciliare le questioni riguardanti la natura dei processi evolutivi.

2. Materiali e Metodi

2.1 Materiale di partenza

            Abbiamo utilizzato sequenze complete di DNA di S. Cerevisiae di recente pubblicazione, di cui 20 isolati selvatici (europei (10 ceppi), Malesia (3 ceppi), giapponese (3 ceppi), Nord America (2 ceppi), dell’Africa occidentale (2 ceppi)) e 17 ceppi di mosaico [23].

Al fine di valutare il livello di vincoli selettivi di ciascun gene, come prima cosa abbiamo  individuato per ogni gene tutti i possibili alleli in base alle informazioni SNP (Single Nucleotide Polymorphism) assegnate a ciascun ceppo. Abbiamo quindi analizzato  tutte le possibili combinazioni di coppie di alleli relativi  a ciascun ceppo utilizzando il programma yn00 nel pacchetto PAML e calcolato le statistiche dN/dS [24]. L’insieme di dati  finale contiene l’elenco completo dei singoli valori d_N/d_S per ogni gene e dei valori delle distanze genetiche (D_s) assegnate a ciascun gene.

2.2 Quadro teorico

            Il nostro modello descrive le dinamiche evolutive fra tre scenari gerarchici rispetto al tempo di divergenza delle popolazioni di lieviti (Fig. 2 per l’illustrazione) . Abbiamo anzitutto descritto le dinamiche evolutive dei ceppi di lieviti selvatici in due intervalli di tempo distinti corrispondenti alla loro divergenza relativa dall’antenato comune. Poniamo ψ come stato evolutivo tra Nψ ceppi di lievito di due popolazioni isolate, e φ come stato evolutivo di ceppi di lievito Nφ all’interno della stessa popolazione. Mentre gli individui Nψ non sono più in grado di scambiare materiale genetico e sperimentano diverse condizioni ecologiche causate dalla barriera geografica, gli individui  Nφ sono liberi di scambiare informazioni genetiche (popolazioni interfertili)  e sono in grado di condividere lo stesso ambiente di crescita. La distanza genetica tra popolazioni differenti è molto più elevata di quella all’interno della stessa popolazione (ψ » φ,), il confronto tra ceppi mosaico rappresenta una distanza genetica a metà strada tra ψ e φ . Chiamiamo questa ‘via intermedia’ come  m  così da poter considerare tre livelli crescenti di distanza genetica corrispondenti al confronto intra-popolazione, tra ibridi, e tra popolazioni (la distanza genetica si misura con l’usuale metodo della distanza di Nei e quindi del numero di differenze nelle sequenze del DNA), ci aspettiamo che la distanza genetica cresca nell’ordine come:  φ → m → ψ  e rappresenta quindi una transizione graduale tra i diversi stati i all’interno dello stesso paesaggio evolutivo. La struttura cromosomica unica dei ceppi mosaico ci permette di esplorare come miscele casuali di origini cromosomiche distinte possano dare origine  ad una forma genotipica e fenotipica stabile e servire come stadio intermedio in un continuum della traiettoria evolutiva. Dopo aver definito un set di tre traiettorie evolutive continue, abbiamo calcolato tutti i possibili confronti tra i ceppi di ogni stato evolutivo: φ , ψ e m per ogni gene, i, su N diversi geni, dove [(dN/dS)¹; (dN/dS) ² ; . . . ; (dN/dS )^N] è un vettore di stato nello spazio fenotipico S e [d¹_S  d²_S , . . . ; d^N_S] è un vettore di stato nello spazio genotipico. d_N/d_S (spazio S) e d_s (spazio D) sono calcolati per ogni gene in modo indipendente. Poichè i nostri dati contengono un gran numero di ceppi di lievito (20 ceppi selvatici e 17 mosaico) un confronto incrociato di tutti i ceppi nell’elenco facilita l’osservazione dei piccoli cambiamenti tra i diversi vettori di stato e descrive una dinamica globale della traiettoria evolutiva tra tre stadi evolutivi. Questo permette il confronto delle traiettorie evolutive del paesaggio fenotipico e di quello  genotipico. In altre parole, se le distanze nello spazio S (fenotipico, distanze tra profili (dN/dS ) ) fossero state graduali e correlate con le corrispondenti distanze genetiche (spazio D)  il modello graduale neo-darwiniano sarebbe quello suggerito dai dati, al contrario se ciò non fosse accaduto  e le distanze fenotipiche avessero mostrato una struttura discreta con poche forme ammesse (configurazioni stabili di valori (dN/dS ) ) avremmo una indicazione verso il modello a quasi-attrattori e a equilibri punteggiati.

Inoltre, la preferenza di un profilo fenotipico specifico dovrebbe essere disaccoppiata dalla distanza genetica corrispondente, quindi le dinamiche di traiettoria evolutiva S^φ → S^m → S^ψ dovrebbero essere disaccoppiate da D^φ → D^m → D^ψ. La dimostrazione di tale mancanza di correlazione tra le traiettorie fenotipiche e genotipiche sarebbe la prima indicazione quantitativa sperimentale a supporto della dinamica dell’ equilibrio punteggiato dell’evoluzione.

3. Risultati

3.1 Dinamiche degli attrattori nel paesaggio fenotipico

            Abbiamo per prima cosa esaminato se i vettori di stato mosaico che popolano D^m siano esattamente situate tra D^φ e D^ψ  (gradualità della distanza genetica) mentre i vettori di stato che popolano S^m mostrino una preferenza per S^φ o S^ψ,(due attrattori per il fenotipo):  questa è una prima evidenza di discontinuità tra spazi genetici e fenotipici che è stata effettivamente dimostrata chiaramente (Fig. 2 per l’illustrazione ). Abbiamo calcolato i valori d_N/d_S per un sottoinsieme di N = 1235 geni con almeno 3 mutazioni, ed escluso geni con d_S = 0 o d_N = 0. A differenza degli studi basati su  singoli geni o gruppi funzionali, abbiamo ignorato i vincoli funzionali del singolo gene o dei gruppi funzionali e ci siamo concentrati sul flusso dinamico dell’insieme dei geni nello spazio a due stati in accordo con i vincoli evolutivi. Se il paesaggio fenotipico fosse influenzato da una dinamica simil-attrattiva (con specie che funzionano come attrattori, ogni specie definita da  un caratteristico profilo dN/dS ), dovremmo aspettarci un disaccoppiamento tra gli spazi genotipici (continui) e fenotipici (discreti). Le analisi della distribuzione cumulativa dello spazio a due stati rivela (vedi fig. A.1 in appendice) che, mentre la media dei vettori di stato in D^m mostra più o meno una distanza a metà strada tra D^φ (p = 0, K – S test) e D^ψ ( p = 0,  K – S test), la media dei vettori di stato in S^m sono molto simili a S^ψ  (p = 0,2 ,  K – S test ) rispetto a S^φ ( p = 0,  K – S test). Inoltre la figura 3 evidenzia che mentre la distanza genetica, D, è rappresentata da un continuo di valori  possibili con variazioni infinitesimali per i diversi confronti effettuati che illustrano un paesaggio ergodico, la firma fenotipica globale permette solo due possibili stati discreti. Questa prima prova solleva l’ipotesi di una discontinuità tra gli spazi genotipici e fenotipici. Così le metriche basate sul genotipo mostrano chiaramente che le comparazioni tra mosaico si trovano a metà strada tra i due estremi (specie parentali), mentre nel caso di confronti di spazi fenotipici questa condizione a metà strada non è accessibile, e i ceppi mosaico devono convergere verso uno dei possibili profili specifici delle due specie (Fig. 2 (a)). Insomma è come osservare una transizione di fase. la temperatura può variare gradualmente ma gli stati di aggregazione della materia (solido, liquido, aeriforme) sono discreti, così i ceppi mosaico hanno effettivamente una distanza genetica intermedia tra le due specie ma il loro fenotipo (profilo dei valori (dN/dS ) e quindi struttura delle rete di regolazione genica) non occupa una posizione parimenti intermedia ma deve ‘decidersi’ quale delle due configurazioni stabili seguire.

            Fig. 2 – Mappa genotipo-fenotipo Aspettativa teorica di (a) equilibri punteggiati e (b) gradualismo filetico. Mentre il modello del gradualismo filetico implica  che sia S sia D siano paesaggi ergodici con accessibilità equiprobabile ai vettori di stato, l’equilibrio punteggiato conserva un paesaggio ergodico di D, ma per contro mostra una vasta canalizzazione S con  due soli possibili profili fenotipici. Mentre i vettori di stato mosaico (linee tratteggiate) evidenziano una distanza a metà strada tra genetica tra gli stati evolutivi di φ e ψ, il suo profilo fenotipico potrebbe essere canalizzata solo in un profilo accessibile.

Fig 3 – Comportamento tipo-attrattore nel paesaggio fenotipico. Ogni linea continua rappresenta un vettore di stato di dN/dS o valori d_S per 1.235 geni del lievito equivalente i quali mostrano una traiettoria evolutiva negli stati φ, m e ψ. (a) La comparazione dei ceppi mosaico (m, linea blu) mostra una distanza genetica intermediata tra φ (linea nera) e ψ (linee rosse) conseguente alla riproduzione storica di lievito isolati. Appare evidente che la transizione della traiettoria evolutiva è regolare tra i tre stati evolutivi (D^φ → D^m → D^ψ). (b) In contrasto con la distanza genetica, il profilo fenotipico del mosaico mostra solo una soluzione fenotipica rispetto alla distanza intermedia prevista. Questa discontinuità nel profilo fenotipico che va di pari passo con il carattere lineare della distanza genetica è una prima indicazione di una possibile natura discreta dell’evoluzione.

3.2 Implicazioni della differenza di  nicchie ecologiche nell’auto-organizzazione dei geni

            I geni e le proteine sono integrati in reti relazionali complesse, pertanto ambienti differenti dovrebbero lasciare diverse tracce evolutive sulle proteine durante tutto il processo di evoluzione a partire da modificazioni della topologia della rete. Se le mutazioni non-sinonime riflettono i cambiamenti che le proteine sperimentano nel corso dell’evoluzione e queste proteine lavorano in rete , la quale rete è quindi il ‘fenotipo’ esposto ai processi di adattamento , la distribuzione ‘globale’ dei valori d_N/d_S dovrebbe essere fortemente correlata tra popolazioni appartenenti alla stessa nicchia ecologica e differire per popolazioni provenienti da diverse nicchie ecologiche.Se invece il ruolo funzionale specifico di un gene non dipende dalla sua posizione nella rete ma è qualcosa di legato alla sua specifica funzione (modello geocentrico)il profilo d_N/d_S  non dovrebbe dipendere dalle nicchie ecologiche delle popolazioni a confronto ma solo , appunto, dal gene specifico con valori alti per geni relativamente poco ‘rilevanti’ ai fini evolutivi e valori bassi per geni sottoposti a una selezione più intensa.  D’altro canto la relazione lineare tra il rapporto d_N/d_S di grandi insiemi di geni tra ceppi differenti è una buona indicazione della stabilità funzionale del sistema. Questo può tradursi in una relazione non-lineare nella distribuzione del rapporto d_N/d_S tra popolazioni differenziatesi in termini di nicchia occupata e una stretta correlazione nel secondo, derivante da un ruolo invariante assegnato a ciascun gene.

            Fig. 4 – Esempio di una transizione nella correlazione di Pearson d_N/d_S tra 400 geni. (a) La correlazione lineare si ottiene quando dn / dS viene esaminato tra ceppi diversi della stessa popolazione (r = 0,8) (E = europeo, M = malese, N = nord americano). (b) Rapporti d_N/d_S non correlati (r = 0.5) tra le popolazioni differenziate mostrano che l’intera rete di geni cambia a livello globale. La brusca transizione nei coefficienti di correlazione implica una auto-organizzazione dei geni in risposta a perturbazioni ambientali. L’invarianza lineare di d_N/d_S all’interno della stessa popolazione è l’immagine sotto l’aspetto di proprietà tipo-attrattore delle specie.

            Abbiamo controllato se i paesaggi fenotipici e genotipici mostrano un comportamento diverso quando viene preso in considerazione il coefficiente di correlazione di  Pearson tra i valori d_N/d_S di diversi geni campionati. Al fine di ottenere un quadro completo di tutti i possibili geni e ceppi abbiamo utilizzato analisi iterate per ogni terna di ceppi di ogni stato evolutivo: φ, ψ e m e misurato il coefficiente di correlazione per ogni terna. In questo modo ogni stato evolutivo è rappresentato da un vettore di stato [r (d_N/d_SN¹ , r(d_N/d_SN)²; . . . r (dN/dS_n)^R]dove r (d_N/d_SN)  è il coefficiente di correlazione di Pearson tra geni N per ogni terna e R è il numero di coefficienti calcolati nel vettore di stato. Questo metodo ci permette di controllare la variabilità dei coefficienti di correlazione in d_N/d_S, in φ, m e ψ. Ad esempio: la fig.1 illustra tre popolazioni allopatriche, X ,Y, Z. Se la dinamica dell’evoluzione del gene può essere tracciata da cambiamenti in d_N/d_S, allora possiamo confrontare il coefficiente di correlazione di d_N/d_S tra la terna di ceppi all’interno della stessa popolazione, {x1 , x2, x3} con la correlazione esistente tra popolazioni differenti {x1, y1, z1}. Elevati coefficienti di correlazione tra profili genomici d_N/d_S implicano un ruolo invariante dei geni ed una sostanziale stabilità del profilo fenotipico in conseguenza all’azione di ordinamento delle specie che funge da ‘attrattore’ (il particolare profilo d_N/d_s corrisponde cioè a una configurazione di minima energia corrispondente alla specie stabile)  e che quindi mantiene costante il ruolo funzionale di ciascun gene. Per contro, bassi coefficienti di correlazione indicano un cambiamento nel ruolo funzionale dei differenti geni  e quindi un rimodellamento della rete di relazione tra geni.

Vale la pena notare che qui adoperiamo i termini stabile ed invariante in modo sostanzialmente metaforico, in senso stretto un attrattore corrisponde a una zona specifica dello spazio delle fasi in cui il sistema ritorna dopo una perturbazione non troppo forte, la larghezza del bacino di attrazione dell’ attrattore (la regione dello spazio delle fasi da cui il sistema, in seguito alla scomparsa dei transienti, torna all’attrattore stesso) è una misura della sua stabilità. Non possiamo giudicare l’effetto di una perturbazione sulla dinamica di popolazione e di specie poichè queste perturbazioni si verificano nel corso di un tempo troppo lungo per essere apprezzate sperimentalmente, cosicchè deduciamo questo tipo di dinamiche dagli effetti su ciò che possiamo (staticamente) osservare. Quindi la presenza di stati preferenziali corrispondenti a un profilo invariante di valori di d_N/d_S, che producono una forte correlazione tra due popolazioni della stessa specie, può essere considerato come la conseguenza dell’esistenza di uno stato stabile (attrattore) in cui ogni gene mantiene il suo caratteristico valore di d_N/d_S che, essendo a sua volta dipendente dal ruolo fenotipico specifico svolto da tale gene, rivela una sostanziale stabilità fenotipica.

            La variabilità osservata nel coefficiente di correlazione fra le tre (intra-popolazione, ibridi, inter-poplazioni)  traiettorie evolutive è importante per comprendere come la barriera genetica e la migrazione della popolazione verso ambienti diversi possano operare a livello dell’intero genoma in modo dinamico. I nostri risultati mostrano una relazione lineare in d_N/d_S tra i ceppi dalla stessa popolazione (r mediana ≈ 0.8 , 4970 confronti di terne), questo è previsto dall’ immobilità naturale della popolazione di lieviti e dall’abilità di scambiare liberamente materiale genetico. In tal caso si suppone che la topologia della rete è relativamente stabile con piccole perturbazioni dall’ambiente e una prova concettuale del fatto che la specie si comporta come uno stato attrattore che mantiene invariato il  valore d_N/d_S specifico del gene  (Fig. 4). In contrasto con la correlazione lineare tra i ceppi nel set di popolazione, i coefficienti di correlazione medi scendono in modo significativo tra i ceppi di diverse popolazioni (mediana r = 0.45, 4950 confronti tra terne). Le variazioni estreme dei valori di d_N/d_S relativi agli stessi geni potrebbero essere spiegate con l’adattamento dinamico e rapido dei geni ai nuovi ambienti e dalla plasticità della rete di regolazione dei geni, tale che lo stesso gene si trova a  svolgere un ruolo diverso in due specie differenti. Di notevole interesse ed in linea con la nostra osservazione precedente, vediamo che il confronto tra i ceppi mosaico mostra altresì una correlazione relativamente bassa (median r = 0.51, 7140 confronti tra terne). Questi risultati supportano la nostra precedente osservazione della presenza di un attrattore dinamico dello spazio fenotipico. In altre parole i confronti fenotipici non consentono un gradiente continuo di differenze come nel caso di distanze genetiche, essendo attratti solo da specifiche soluzioni accessibili per profilo fenotipico generale (Fig. 5 per l’illustrazione).

            Fig 5 – L’illustrazione rappresenta schematicamente un ipotetico attrattore nello spazio fenotipico. (a) L’evoluzione discreta del profilo fenotipico rispetto all’evoluzione lineare della distanza genetica nei due paesaggi (S,D) suggerisce una stabilità temporale del regime attrattivo (stati I, III) fino a brevi periodi di instabilità durante l’approccio al prossimo attrattore (stato II) . Durante il periodo in cui una traiettoria (frecce solide) visita l’attrattore,  le mutazioni continuano ad accumularsi linearmente nel tempo (le frecce tratteggiate sono scalate per dimostrare che il momento della transizione di stato è molto più breve rispetto ai periodi dell’attrattore). Ci si aspetta che i vettori di stato degli individui della stessa popolazione (Sφ) mostrino una relazione lineare tra i diversi geni e una relazione non lineare tra individui di popolazioni divergenti (Sψ). (b) Sosteniamo che il paesaggio genotipico, D, non è influenzato da una dinamica attrattiva (paesaggio ergodico) se il profilo fenotipico dei mosaici (M) è attratto da un solo possibile profilo fenotipico (attrattore), anche se la distanza genetica è più o meno a metà strada tra Dψ e Dφ (freccia tratteggiata). Le due immagini (a, b) rappresentano uno schizzo del modello dell’equilibrio punteggiato che è caratterizzato da una discontinuità tra la distanza genetica e i profili fenotipici e che potrebbero essere spiegati nel quadro di sistemi dinamici non lineari.

4. Discussione

In questo lavoro, per la prima volta, si studia l’ evoluzione del genoma effettuando un confronto tra il genotipo e il fenotipo di popolazioni allopatriche delle specie S. Cerevisiae tenendo conto dei dati globali di variazione del DNA come segno distintivo delle dinamiche evolutive. Abbiamo dimostrato che una distribuzione ampia e continua delle distanze genetiche va insieme alla  presenza di pochi attrattori discreti nello spazio dei profili fenotipici. Questa osservazione ci aiuta a conciliare due teorie evolutive contrapposte: gradualismo filetico ed equilibri punteggiati: il gradualismo vale solo a livello di distanze genetiche mentre il fenotipo varia a salti quando il sistema arriva ad una soluzione stabile in termini di relazione tra geni. La discontinuità tra lo spazio genotipico e fenotipico ci permette di interpretare la speciazione come la comparsa di  discontinuità fenotipiche derivanti da uno spazio continuo del genotipo. Abbiamo dimostrato che, mentre il paesaggio genotipico presenta uno spazio continuo uniforme, quello fenotipico mostra un paesaggio rugoso di valli e pianure  che induce una dinamica di tipo attrattivo.

Il fatto che il  fenotipo dei mosaico è attratto da uno solo dei vettori di stato corrispondenti alle specie parentali mentre la sua configurazione genotipica è a metà strada tra le due, è una prova concettuale dell’esistenza di fenotipi discreti a livello dell’intero genoma con una sostanziale assenza di fenotipi globali (rete di interazione tra geni, non singoli geni che chiaramente mostrano fenotipi intermedi locali) intermedi  I risultati ottenuti mostrano chiaramente la presenza di profili preferiti di organizzazione fenotipica (come rispecchiato dall’ invarianza lineare dei profili di d_N/d_S all’interno delle specie) plasmando le possibili conseguenze fenotipiche delle variazioni del genotipo.

            Questi risultati forniscono la prima intuizione molecolare nelle dinamiche evolutive e supportano l’evidenza del verificarsi dell’ equilibrio punteggiato a livello molecolare. In primo luogo, il ruolo invariante della funzione del gene, osservato dalla correlazione relativamente elevata di d_N/d_S, mostra che il profilo fenotipico è relativamente stabile per un certo periodo dell’evoluzione che è in analogia ad uno stato attrattore stabile o ad una stasi con piccole variazioni fenotipiche. In secondo luogo, il decadimento verso una bassa correlazione d_N/d_S tra popolazioni potrebbe essere in analogia ad una transizione o salto di stato nel profilo fenotipico mentre il suo approccio al successivo stato stabile (la popolazione sorella) porta nuovamente il profilo verso un nuovo stato fenotipico invariante (una nuova specie). Il fatto che il profilo fenotipico dei ceppi mosaico non possa occupare stati intermedi (pur avendo distanze genetiche intermedie) supporta ulteriormente il modello proposto di specie come stati attrattori.

 Tuttavia ci sono ancora alcune domande che devono essere affrontate. Le  popolazioni di lieviti presentate nel documento non mostrano alcuna barriera riproduttiva [25] e quindi la transizione di stato non presenta eventi di speciazione. Assumiamo pertanto che questo salto nel profilo fenotipico rappresenti una forma di auto-organizzazione dei geni che è richiesta per l’adattamento alle nuove nicchie ecologiche. Tale auto-organizzazione dei geni implica dei cambiamenti nell’architettura genetica (o la topologia di rete)  necessari per mantenere stabilità funzionale.

            Proprietà emergenti sono spesso osservate in molti campi biologici [13-17] e nel lavoro  di Borenstein e Krakauer [13] si fornisce , in ambito puramente simulativi, un modello di relazione genotipo-fenotipo del tipo molti-a-uno analoga a quella che noi troviamo nei lieviti a partire da dati sperimentali. Huang e collaboratori [26] hanno trovato un comportamento di tipo attrattore nel destino delle cellule prendendo in considerazione la traiettoria di espressione genica innescata da due induttori diversi. Il vettore di stato, S (t), è stato usato per descrivere lo stato della rete regolatrice dei geni al tempo t utilizzando il profilo di espressione dei geni: lo stesso tipo cellulare era corrispondente ad un attrattore nello spazio delle fasi multidimensionale delle espressioni geniche. Questo risultato spiega come mai i tipi cellulari siano solo attorno a 200 a fronte di circa 30000 geni ognuno variabile su quattro ordini di grandezza che, nel caso di una struttura di regolazione continua porterebbe a un numero transfinito di profili e non certo solo a due centinaia [27,28]

Analogamente altri scienziati hanno riscontrato un’occorrenza di un discreto numero di ripiegamenti di proteine (folds) che rendono ragione nello spazio delle configurazioni ammesse di una variabilità continua delle sequenze proteiche  [29]. Nel caso delle proteine questa drastica riduzione delle configurazioni ammesse deriva direttamente dai vincoli energetici che modellano le dinamiche del ripiegamento proteico. Il nostro studio, per la prima volta, fornisce indizi di una differente forma di drastica discretizzazione biologica derivante da un panorama energetico ancora sconosciuto ma che ha vincolato lo sviluppo evolutivo canalizzandolo verso forme ‘fisicamente ammesse’. Questo tipo di evoluzione è in linea con i principi fondamentali della teoria dell’equilibrio punteggiato sostenuta dai paleontologi.

            Siamo ancora molto lontani dall’avere una conoscenza delle correlazioni tra geni che limitano lo spazio di d_N/d_S dando così origine a profili riconoscibili per le popolazioni che sperimentano lo stesso ambiente anche in presenza di una variazione genetica non vincolata. Tuttavia la scoperta di tali vincoli potrebbe essere importante per rendere ragione della crescente evidenza  di vincoli fenotipici sull’evoluzione [30,31].

Fig. A.1 – Confronto di specie incrociato dei vettori di stato medi. La figura mostra che la distanza genetica media ds dei ceppi mosaico è esattamente a metà tra φ e ψ per tutte le possibili combinazioni (a), sebbene il loro pattern fenotipico mostri una significativa somiglianza alla curva fenotipica tra le specie (b)

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare il Dott. Amerigo Barzaghi per aver indirizzato la nostra attenzione su importanti aspetti della biologia evolutiva

Appendice

Vedi Fig. A.1.

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